16S 分析环境搭建

生信喵

一、16S 分析软件比较
       16S 的分析软件有很多，2009 年 mothur 软件发布，可以在一款软件中完成 16S 的分析，在2010 年发布 qiime1 软件，qiime 其实是一个流程，里面整合了多种方法，例如 OTU 聚类就有 mothur 和 USEARCH 方法。2010 年发布 usearch，usearch 一款工具即可完成 16S 全部的分析内容。usearch 作者是该领域内非常有名的 Robert C.Edgar 的作品，而且软件一直在更新进化，从最开始的 UPARSE 算法，到 UCHIME 嵌合体检测算法，在到后来的 Unoise2 和Unoise3。不过 Usearch 软件 64 位版本是收费的，而 32 位软件免费，32 位软件最大只能使用 4G 内存，对于大数据处理不方便。
       由于 USEARCH 不开源，并且没有给出其软件中具体算法的详细描述。最主要的原因还有USEARCH免费的版本只有32位版本在使用时有4GB的使用内存限制。于是Torbjørn Rognes模仿 usearch，在 2016 年发布了 vsearch，VSEARCH 是一个开源免费的 64 位，无内存限制的扩增子数据处理分析软件，且功能和结果与 usearch 类似。
       同年，2016 年发布了 dada2 软件，dada2 是一个 R 包，dada2 挑战了之前 16S 数据分析的金标准 OTU，推出了 ASV 的新概念，目前已经有越来越多的学者开始转向 ASV 的聚类算法，成为 16S 研究的新标准。
       2019 年，qiime 升级到了新版本 qiime2，qiime2 摒弃之前 qiime1 的方法，重新构建 qimme2，是 qiime2 变成一个平台工具。

1. mothur：http://mothur.org/
   
2. qiime2： https://www.qiime2.org
   
3. vsearch：https://github.com/torognes/vsearch
   
4. usearch：http://www.drive5.com/usearch/
   
5. data2：https://benjjneb.github.io/dada2/index.html
   
6. phyloseq：https://github.com/joey711/phyloseq
   
7. vegan：https://vegan.r-forge.r-project.org
   

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      无论使用哪款软件，16S 的核心都是得到 OTU/ASV 矩阵，和物种分类矩阵。后续统计分析基于矩阵。
      
        16S 得到矩阵之后分析

二、数据库下载
2.1 Silva
       SILVA 数据库，SILVA 数据库由德国马普研究所和 Ribocon 主持，提供最新的核糖体大小亚基 rRNA 注释信息。SILVA 数据库是软件包 ARB 的官方数据库，提供全面的，高质量的可比对的小亚基（如 16S/18S，SSU），以及大亚基（23S/28S，LSU）的 rRNA 序列，用于细菌，古生菌，以及真菌分析。silva 也是 mothur 软件中推荐使用的数据库。silva 数据库里面包含五个独立的部分，分别是小亚基的 SSU Parc，SSU Ref 以及 SSU Ref NR，还有大亚基的 LSU Parc 与 LSU Ref。
       这些库之间有什么差别呢。这是根据不同的序列长度以及聚类的序列相似性来生成的。官网上面有详细的介绍。我们可以通过网页或者 ftp 服务器下载 silva 的数据库。里面包括 arb 文件和 fasta 文件，如果不使用 arb 的软件，我们只需下载 fasta 的文件。ARB_files 存储的为arb 格式的文件，Export 为 fasta 序列格式的文件。在 16S 序列分析中，我们推荐使用 SSU Ref NR 这个数据库，这个是使用 99%的 identity 标准来进行非冗余处理，准确性更高，在 18S序列分析中，使用 LSU Ref。并且这些版本的数据库包含一个 Guide Tree。

1. 网站链接：http://www.arb-silva.de/

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      最大最全的数据库，但是缺点是假阳性率会更高。


2.2 GreenGene
       Greengenes 数据库由 Lawrence Berkeley National Laboratory 构建。目前已经不再提供更新。之前很多 16S 分析软件默认的库都是 GreenGene，例如 qiime 软件中默认使用的是greengene 数 据 库 ， 为 97_otus.fasta 这 个 文 件 ， 以 及 一 个 对 应 的 注 释 文 件97_otu_taxonomy.txt，一个构建好的系统发育树 97_otus.tree。16S 功能分析工具 PICRUSt也是基于该数据库的。主要是人工整理，比较准确。分类采用常用的七级界门纲目科属种，方便理解和阅读。

1. https://greengenes.secondgenome.com/

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2.3 RDP
       RDP 数据库来自于（Ribosomal Database Project），是由密歇根州立大学开发维护的在线工具，包括数据库和分析工具两部分。 其中数据库提供核糖体相关数据和服务，包括在线的数据分析、比对、16S rRNA 序列的注释。RDP 数据库提供 16S rRNA序列比对和分类、进化树构建、物种分类 heatmap、功能基因分析等方便的数据处理功能。RDP 项目提供了完整的 16S 和 18S 分析方案。

1. http://rdp.cme.msu.edu/

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2.4 UNITE
       UNITE 数据库的全称是 User-friendly Nordic ITS Ectomycorrhiza Database，直译过来是北欧友好的外生菌根真菌 ITS 数据库。它并不包含所有真菌 ITS 的参考序列，因为这方面目前累计的数据还比较少，没有 16S 或者 18S 的信息那么多。虽然里面包含的真菌序列不是特别全，但是 UNITE 数据库官方介绍它的一大优势是准确性比较高，追求质量和放弃数量。数据库筛选过程比较严格，收入的都是高质量以及分类鉴定很清晰的真菌。里面包含一个 fasta格式的序列文件，用于比对，以及一个比对之后的点 tax 格式的物种注释文件。这个和 16S的类似。ITS 的分析同样可以使用 16S 分析的各种流程软件。

1. https://unite.ut.ee/

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三、软件安装
3.1 16S 分析软件安装

1. #创建16S虚拟环境
   
2. conda create -n 16s -y
   
3. conda activate 16s
   
4. conda install -y sabre
   
5. conda install -y vsearch
   
6. conda install -y cutadapt
   
7. conda install -y fastqc
   
8. conda install -y multiqc
   
9. conda install -y bioconductor-phyloseq
   
10. conda install -y bioconductor-dada2
    
11. conda install -y r-vegan
    
12. conda install -y bioconductor-decipher
    
13. conda install -y bioconductor-msa
    
14. #安装picrust2
    
15. conda create -n picrust2 -y picrust2
    
16. conda activate picrust2

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3.2 qiime 软件安装
       conda 安装 qiime2

1. wget https://data.qiime2.org/distro/core/qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml
   
2. conda env create -n qiime2-2022.2 --file qiime2-2022.2-py38-linux-conda.yml
   
3. conda activate qiime2-2022.2

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3.3 下载数据库

1. #https://nmdc.cn/datadownload
   
2. #RDP
   
3. lftp        
   
4. ftp://download.nmdc.cn/tools/soft/EasyAmplicon/usearch/
   
5. mget rdp_16s_v16_sp.fa.gz
   
6. 
   
7. #SILVA
   
8. lftp ftp://download.nmdc.cn/tools/silva/
   
9. mget silva_16s_v123.fa.gz
   
10. 
    
11. #UNITE
    
12. lftp ftp://download.nmdc.cn/tools/soft/EasyAmplicon/usearch/
    
13. mget utax_reference_dataset_all_04.02.2020.fasta.gz
    
14. 
    
15. #从qiime2网站下载
    
16. #https://docs.qiime2.org/2022.2/data-resources/

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