blast 的应用

生信喵

一、物种鉴定
        当拿到一条未知序列时，可以直接与 ncbi nt 库或者 nr 库进行 blast 比对，鉴定未知序列。

1. #nt库比对
   
2. blastn -db nt -query assembly.fasta -out blast.out  -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 12

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二、基因功能注释
        这种原理上与物种鉴定类似，也是通过比对，根据已知的信息来推测未知的信息。对于未知的基因，与基因功能数据库进行比对。过滤之后，比对到最近源基因所具有的功能，也就是未知基因具有的功能。这里我们看到，已知功能基因数据的准确性非常重要，否则未知基因功能就会被定义错误，如果这个错误累积起来，将会越累积越多。目前的基因功能注释主要都是采用这种方式。一般利用氨基酸的直接比对来做，比如可以做 nr 库、cog 数据库等。

1. #nr库比对
   
2. blastn -db nr -query gene.fa-out blast.out -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 12

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三、筛选质粒

1. #质粒数据库
   
2. ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/plasmid/ #质粒
   
3. #下载质粒数据库
   
4. alias 'aspera=~/.aspera/connect/bin/ascp -i
   
5. ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh -QTr -k 1 -l 50m'
   
6. #批量下载
   
7. for i in {1..10};do echo aspera
   
8. anonftp@ftp.ncbi.nlm.nih.gov:refseq/release/plasmid/plasmid.${i}.1.genomic.fna
   
9. .gz ./;done; #与质粒库进行 blast 比对
   
10. blastn -query assembly.fasta -db ../data/plasmid/plasmid.fa -out plasmid18.txt
    
11. -outfmt 6 -html -evalue 1e-5 -num_threads 12
    
12. #提取 id
    
13. cat plasmid.txt | awk '{if ($3 >80 && $4 > 100 ) print $1}' | sort | uniq >id.list
    
14. #提取序列
    
15. seqkit grep -r -f id.list assembly.fasta -w 0 >plasmid_4.fa

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四、筛选共有基因。
        将两个基因集氨基酸序列进行 blast 比对，将比对上的序列 ID 筛选出来。

1. #筛选共有基因
   
2. #建立索引
   
3. makeblastdb -in ref.faa -dbtype prot -parse_seqids -out ref.faa
   
4. #blastp比对
   
5. blastp -query query.faa -out blast.out -db ref.faa -outfmt 6 -evalue 1e-5
   
6. #筛选id
   
7. cat blast.out |awk '{if ($3 >=80 && $4 >=100 ) print $2}' | sort  |uniq >id.list
   
8. #提取序列
   
9. seqkit grep -r -f id.list ref.faa

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五、diamond 比对
5.1 diamond 介绍
        diamond 是 2015 年发表的一款新的序列比对工具，与 blast 类似。diamond 可以应用于物种分类的鉴定，比对之后，直接导入 megan 软件进行物种分类以及数据可视化。相比于 blast程序，具有以下特点。
        1、只能进行氨基酸水平比对，不能做核酸水平比对；
        2、比对速度比 blast 程序快 100x-10,000x 倍；
        3、可以进行长读长测序 reads 的比对；
        4、可以输出 blast，sam 格式，列表已经 xms 等多种格式；
        5、比对精度地域 blastp；
        6、diamond 的软件版本要与数据库版本一致。

1. v0.9.25 to current produce format version 3 and accept format version 2-3.
   
2. v0.9.19 to v0.9.24 produce and accept format version 2.
   
3. v0.9.0 to v0.9.18 produce and accept format version 1.
   
4. v0.8.12 to v0.8.38 produce and accept format version 0.

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       网址：https://github.com/bbuchfink/diamond

5.2 软件安装使用
1 软件安装

1. #bioconda 安装
   
2. mamba install -y diamond
   
3. #现在预编译程序
   
4. wget
   
5. http://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v2.0.13/diamond-linux64.
   
6. tar.gz
   
7. tar xzf diamond-linux64.tar.gz

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2 选项参数
        https://github.com/bbuchfink/diamond/wiki/3.-Command-line-options
功能选项：
        makedb ：建立索引
        blastp：blastp 模式比对

        blastx：blastx 模式比对
        view：显示 DAA 格式结果
        help：帮助信息
        version：显示版本
        getseq：从库文件中提取序列
        dbinfo：数据库信息 、
        test ：运行测试
        makeidx：为数据库建立索引
通用选项：
        --threads/-p： 线程数
        --db/-d <file>： 输入比对数据库
        --out/-o <file>： 输出文件
        --outfmt/-f： 输出文件格式，默认 6（表格）
        --header：输出表头信息
建库选项：
        --in：输入文件
        --taxonmap ：物种分类库 mapping 文件
        --taxonnodes ：物种分类库 nodes 文件
        --taxonnames：物种分类库 names 文件
比对选项：
        --query/-q ：输入比对序列
        --strand：比对方向
        --evalue/-e： 比对的最大 evalue 值（默认 0.001)
        --max-target-seqs/-k：比对到的最大序列数，默认值是 25
        --top： 百分数的形式表示
        --min-score：最小评分
        --id: 给出指定百分比的数据
        --subject-cover：最小覆盖度
选择比对速度与敏感度
        --fast
        --mid-sensitive
        --sensitive
        --more-sensitive
        --very-sensitive
        --ultra-sensitive


5.3 使用案例
1、blastp 比对

1. #建立索引
   
2. diamond makedb --in ref.faa --db ref
   
3. diamond 比对
   
4. diamond blastp -q query.faa -d ref -o blastp.txt -p 12 -f 6

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2、物种鉴定

1. #检查数据库版本
   
2. diamond dbinfo -d /nr_diamond/nr.dmnd
   
3. diamond dbinfo -d /diamond_20210825/nr.dmnd
   
4. #diamond 比对
   
5. diamond blastx -q P15.fastq.gz --db diamond
   
6. /diamond_20210825/nr -o blastx -p 12 -f 100
   
7. #可视化
   
8. diamond view -a blastx.daa

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