了解测序这件事

生信喵

一、为什么要学习测序原理？
      1、测序是现在以及未来生物学研究的基础；
      2、测序原理是生物数据分析的基础；
      3、测序质量直接影响分析结果；
      4、生物软件针对特定数据开发；
      5、了解测序原理才能选择合适的科学研究方案。


二、理想中的DNA测序
      1、DNA原来有多长就测序多长
      2、测序过程要比较简单
      3、测序速度快
      4、结果准确
      5、价格便宜


三、测序仪厂商
      illumina： http://www.illumina.com/
      Thermofisher： https://www.thermofisher.com
      PACBIO： https://www.pacb.com/
      BGISEQ： http://www.seq500.com/
      nanopore： https://nanoporetech.com/
      SOLiD： https://www.thermofisher.com/
      GeneReader: https://www.qiagen.com/
      454 测序仪： https://www.roche.com/
      Ion Torrent： https://www.thermofisher.com/cn/en/home/brands/ion-torrent.html
      GenoCare： http://www.directgenomics.com/


四、当前市场主流测序平台

      目前测序市场上是一二三代共存的现状，主流的测序仪设备主要包括一代的 3730，二代的illumina 和华大基因的 DNBseq，三代的 pacbio 和纳米孔测序，Ion Torrent 主要用于临床诊断。

      

五、测序技术发展史
      1865 年 孟德尔遗传定律
      1866 年 Nirenber 和 Khorana 破译了遗传密码字典的全部 64 个三联体密码子
      1869 年 Friedrich Miescher 发现和分离出脱氧核糖核酸
      1885-1901 年 Albrecht Kossel 解析出 ACGTU 五种碱基
      1929 年 Phoebus Levene 首次分离出 DNA 的四种碱基和磷酸基团
      1944 年 Oswald Avery, Colin MacLeod and Maclyn MCarty 肺炎双球菌实验证明 DNA 为遗传物质
      1952 年 Alfred Hershey and Martha Chase 噬菌体侵染实验确认 DNA 为遗传物质
      1953 年 Francis Crick, James Watson 和 Maurice Wiikins 提出双螺旋结构
      1955 年 Frederick Sanger 完成胰岛素蛋白测序
      1956 年 Arthur Kornberg 发现了 DNA 聚合酶
      1958 年 Francis Crick 提出“中心法则”
      1965 年 Robert Holley 完成丙氨酸的 tRNA 测序(77 nt)，耗时 7 年(3 年分离 RNA, 4 年测序)
      1972 年 Paul Berg 利用限制性酶完成了首个体外重组 DNA
      1977 年 Walter Gibert 和 Allan M. Maxam 发明了化学降解法测序，Frederick Sanger 和Coulson 开创了双脱氧链终止法并完成了第一个噬菌体全基因组的测序
      1983 年 Kary Mullis 发明 PCR 作为体外扩增 DNA 的方法
      1986 年 Leroy E.Hood 开发第一台半自动化测序仪(1982 年开发蛋白测序仪，1983 年 DNA合成仪，1984 年开发肽链合成仪)
      1987 年 第一款全自动测序仪 ABI 730
      1990 年 美国正式启动人类基因组计划
      1991 年 提出纯双端 shotgun 测序的理论描述，要求片段大小一致。
      1995 年 人类基因组物理图谱完成，Applied Biosystems 推出 AB310，是人类基因组计划的基础设备。测序完成第一个细菌全基因组测序；
      1996 年 Pal Nyren, Mostafa Ronaghi 和 Mathias Uhlen 发明了焦磷酸测序法；毛细管电泳测序仪
      1997 年 大肠杆菌基因组测序完成
      1998 年 ABI 3700 测序仪
      1999 年 中国获准加入人类基因组计划
      2000 年 果蝇基因组测序完成
      2002 年 小鼠基因组测序完成
      2003 年 人类基因组计划完成
      2005 年 HapMap 项目完成，454 公司推出了第一款二代测序仪
      2006 年 Illumina Solexa 测序仪
      2007 年 世界首份“个人版”基因图谱完成；罗氏收购 454 测序技术，推出了改进型测序仪；ABI 推出 SoliD 测序仪
      2008 年 千人基因组测序计划启动，Illumina 推出了 Genome Analyzer
      2009 年 Single-molecule Real-time (SMRT)单分子实时测序
      2010 年 Life Technologies 推出了 Ion PGM 测序仪，Illumina 推出了 Hiseq 2000
      2011 年 Illumina 推出了 MiSeq 系列
      2012 年 Illumina 推出了 Hiseq 2500
      2014 年 Illumina 推出了 HiSeq X Ten 测序仪
      2015 年 Illumina 推出了 HiSeq X 5 / HiSeq 4000 / Miseq 500,华大基因推出了 BGISEQ 500
      2016 年 华大基因 BGISEQ 50，Illumina 推出了 MiniSeq，灵活的桌面测序仪，可以检测单个基因或者整个通路。smidgION 手机测序仪（研发中）
      2017 年 Illumina 推出了 NovaSeq，进一步降低测序成本。GridON X5 桌面测序仪，每次运行产出 100G 数据。华大智造 MGISEQ-200/2000
      2018 年 Illumina 推出了 iSeq 100，华大智造推出 MGISEQ-T7，illumina 将以大约 12 亿美元的价格收购 Pacfic Biosciences。
      2020 年 Illumina 发布了 NextSeq™ 1000 和 NextSeq 2000 测序系统

六、基因测序发展历程
      

七、测序原理视频
      Sanger 测序原理：https://v.qq.com/x/page/d0124c0k44t.html
      illumina 测序原理： https://v.qq.com/x/page/i0770fd7r9i.html
      PacBio 第三代 SMRT 单分子测序：https://v.qq.com/x/page/r03534cry7u.html
      Ion torrent 测序原理：https://v.qq.com/x/page/v01754s6r82.html
      Oxford Nanopore： https://v.qq.com/x/page/v0746ixokzz.html


八、不同测序平台比较
      衡量测序仪的几个指标（这个指标下表现最好的设备）
      准确性：sanger
      读长：nanopore
      价格：MGI，illumina
      数据量：illumina
      仪器价格：nanopore
      测序时间：nanopore
      单碱基价格：MGI，illumina
      建库容易：nanopore


九、人全基因组测序价格比较
      

十、自己测序还是外包？
      1、看数据量；
      2、综合评估测序成本；
      3、是否需要快速拿到数据；
      4、科研还是应用；

      样本少就选择外包，因为公司很成熟了，测样本很多。

十一、截止2019年SRA数据库测序样品统计
      

十二、DNA测序四个步骤
      1、提取DNA（或者RNA）
      2、建库
      3、测序
      4、碱基识别


十三、关于测序的几个问题？
      1、生物DNA如何变成测序数据？
      2、测序对生物样品有什么要求？
      3、如何选择合适测序平台？
      4、测序读长、文库大小对数据分析有何影响？
      5、DNA质量不好还能否进行测序，有哪些影响？
      6、需要测序多少数据量？


十四、DNA提取
      1、手工提取；
      2、磁珠法；
      3、DNA自动提取试剂盒；
      4、DNA自动提取设备；

      磁珠法提取核酸