qiime2实战

生信喵

      本案例是 qiime2 官方教程中的案例，来自于文章《Moving pictures of the human microbiome》在 2011 年发表于 Genome Biology。主要是为了研究人体微生物在使用抗生素之后动态的变化，选取 2 个人，四个身体部位，五个时间点的微生物组样本进行测序研究，第一个时间点紧接着是抗生素的使用，一共 40 个测序样品。
      本教程中使用的数据基于 Illumina HiSeq 产出，使用地球微生物组计划扩增 16S rRNA 基因高变区 4（V4）测序的方法。

1. https://docs.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/

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一、准备数据centos安装docker

1. #移除docker旧版本
   
2. sudo yum remove docker docker-client docker-client-latest docker-common docker-latest docker-latest-logrotate docker-logrotate docker-selinux docker-engine-selinux docker-engine
   
3. #安装必要的系统工具
   
4. sudo yum install -y yum-utils device-mapper-persistent-data lvm2
   
5. #添加软件源信息
   
6. sudo yum-config-manager --add-repo http://mirrors.aliyun.com/docker-ce/linux/centos/docker-ce.repo
   
7. #更新yum缓存
   
8. sudo yum makecache fast
   
9. #安装docker ce
   
10. sudo yum -y install docker-ce
    
11. systemctl start docker
    
12. docker run hello-world
    
13. systemctl status docker
    
14. systemctl stop docker
    
15. 
    
16. #docker阿里云加速
    
17. #/etc/docker/daemon.json中写入如下内容(如果文件不存在请新建该文件)
    
18. {
    
19. "registry-mirrors":["https://alzgoonw.mirror.aliyuncs.com"]
    
20. }
    
21. sudo systemctl daemon-reload
    
22. sudo systemctl restart docker
    
23. #测试
    
24. sudo groupadd docker               #添加用户组
    
25. sudo gpasswd -a xiehs docker    #将当前用户添加至用户组
    
26. newgrp docker                      #更新用户组
    
27. #docker run hello-world

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安装qiime2

1. #docker安装
   
2. docker pull quay.io/qiime2/core:2022.2
   
3. #验证docker安装
   
4. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime

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二、下载及拆分数据

1. mkdir qiime2-moving-pictures-tutorial
   
2. cd qiime2-moving-pictures-tutorial
   
3. #下载metadata
   
4. wget \
   
5.   -O "sample-metadata.tsv" \
   
6.   "https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/sample_metadata.tsv"
   
7. #下载测序数据
   
8. mkdir emp-single-end-sequences
   
9. wget \
   
10.   -O "emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz" \
    
11.   "https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz"
    
12. wget \
    
13.   -O "emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz" \
    
14.   "https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz"
    
15. 
    
16. #导入数据
    
17. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools import \
    
18.   --type 'EMPSingleEndSequences' \
    
19.   --input-path emp-single-end-sequences \
    
20.   --output-path emp-single-end-sequences.qza
    
21. 
    
22. #查看信息
    
23. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools peek emp-single-end-sequences.qza
    
24. 
    
25. #解压文件
    
26. #unzip emp-single-end-sequences.qza
    
27. 
    
28. #=========================
    
29. #  2 拆分样品Demultiplexing     #
    
30. #=========================
    
31. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime demux emp-single \
    
32.   --i-seqs emp-single-end-sequences.qza \
    
33.   --m-barcodes-file sample-metadata.tsv \
    
34.   --m-barcodes-column barcode-sequence \
    
35.   --o-per-sample-sequences demux.qza \
    
36.   --o-error-correction-details demux-details.qza
    
37. #总结信息
    
38. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime demux summarize \
    
39.   --i-data demux.qza \
    
40.   --o-visualization demux.qzv
    
41. #查看信息

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1. https://view.qiime2.org/

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     将qzv下载到本地，打开qiime浏览器上传。
      根据 barcode 拆分之后统计
      
      
      交互式质控图

1. #查看当前步需要引用的文献
   
2. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools citations demux.qza

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三、质控过滤以及生成特征表方法一：data2

1. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime dada2 denoise-single \
   
2.   --i-demultiplexed-seqs demux.qza \
   
3.   --p-trim-left 0 \
   
4.   --p-trunc-len 120 \
   
5.   --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
   
6.   --o-table table.qza \
   
7.   --o-denoising-stats stats.qza
   
8. 
   
9. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime metadata tabulate \
   
10.   --m-input-file stats.qza \
    
11.   --o-visualization stats.qzv

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方法二：deblur

1. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime quality-filter q-score \
   
2. --i-demux demux.qza \
   
3. --o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
   
4. --o-filter-stats demux-filter-stats.qza
   
5. 
   
6. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime deblur denoise-16S \
   
7.   --i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
   
8.   --p-trim-length 120 \
   
9.   --p-sample-stats \
   
10.   --o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
    
11.   --o-table table-deblur.qza \
    
12.   --o-stats deblur-stats.qza
    
13. 
    
14. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime metadata tabulate \
    
15.   --m-input-file demux-filter-stats.qza \
    
16.   --o-visualization demux-filter-stats.qzv
    
17. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime deblur visualize-stats \
    
18.   --i-deblur-stats deblur-stats.qza \
    
19.   --o-visualization deblur-stats.qzv

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     如果使用这个方法，就将生成的文件名修改为方法一

1. mv rep-seqs-deblur.qza rep-seqs.qza
   
2. mv table-deblur.qza table.qza

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四、特征表和特征序列汇总

1. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime feature-table summarize \
   
2.   --i-table table.qza \
   
3.   --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv \
   
4.   --o-visualization table.qzv
   
5. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime feature-table tabulate-seqs \
   
6.   --i-data rep-seqs.qza \
   
7.   --o-visualization rep-seqs.qzv

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     将qzv下载到本地，打开qiime浏览器上传查看。

五、构建进化树用于多样性分析

1. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
   
2.   --i-sequences rep-seqs.qza \
   
3.   --output-dir phylogeny-align-to-tree-mafft-fasttree
   
4. #或者
   
5. docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
   
6.   --i-sequences rep-seqs.qza \
   
7.   --o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
   
8.   --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
   
9.   --o-tree unrooted-tree.qza \
   
10.   --o-rooted-tree rooted-tree.qza

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     可以将tree.qza文件解压后，data目录下nwk文件下载到本地，上传至https://itol.embl.de/网站即可看到发育树。