扩增子分析原理

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一、扩增子简介
1.1 测序原理
       扩增子测序是宏基因组研究中的一种重要方法。扩增子顾名思义就是通过 PCR 扩增的方法获取研究序列。扩增子测序是一种高靶向性方法，用于分析特定基因组区域中的基因变异。
       扩增子测序主要包括 16S rDNA 测序、18S rDNA 测序、ITS 测序及目标区域扩增子测序等。由于 16S 测序较多，一般也直接成为 16S 测序。采用第二代高通量测序平台测定的 16S/18S /ITS 某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用，同时也是系统发育和分类学研究中一种广泛使用的方法，特别是应用于不同的宏基因组学样本中。
       为什么可以选择扩增子作为宏基因组物种分类的研究对象。这是因为 16S，18S 和 ITS 区域有高度的保守性，且存在一定的高变区，在不同物种之间有明显的差异，可以作为物种分类的 Marker Gene。

1.2 扩增子分析内容
       扩增子分析结果包括三部分，1、物种分类结果；2、物种分类丰度信息；3、群落功能信息；
       其中物种分类和丰度是主要内容。能够对给定的一个微生物群进行定性和定量。扩增子的功能分析采用一种预测的方式。
       最后就是很多生态学统计内容和可视化，例如 alpha 多样性和 beta 多样性。所以，目前扩增子的分析内容还是非常多的。

二、宏基因组与 16S 比较

	扩增子测序	宏基因组	宏转录组
研究对象	16S/18S/ITS 等扩增产物	全部 DNA	全部 mRNA
是否需要PCR扩增	需要	不需要	需要
资金成本	较低	较高	较高
获得结果	物种组成及多样性	物种组成，多样性以及基因功能	基因表达差异信息以及基因功能
物种组成信息	一次研究只包括细菌（16S）或真菌（18S 或 ITS），无法得到全部物种	可以得到细菌，真菌以及病毒信息	可以得到细菌，真菌以及病毒信息
分析难度	简单	较难	较难
优势	不用考虑宿主污染问题，价格便宜，适合大样本研究	无需扩增，包含全部DNA信息	可以得到基因表达差异信息
局限性	存在 PCR 偏好性	测序数据量大，价格高，无法得到基因表达信息	RNA 不稳定，建库难度较大，基因信息不完整

扩增子测序优势：
       1、价格便宜；
       2、通过扩增，不受宿主的影响；
       3、数据量小，容易分析；
       4、16S 数据库信息比宏基因组全，可以鉴定出更多的内容；
       5、数据量小，很容易达到饱和。
缺点：
       1、只能得到细菌或者真菌信息；
       2、扩增存在偏好性；
       3、非全长测序，存在误差；
       4、不能做功能分析。

三、扩增子分类
3.1 16S
       16S rDNA(16S ribosome RNA gene)是指编码核糖体上 16SrRNA 亚基的基因。在这里需要说明的一点是通常 rRNA 指的是 rDNA 的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的 rRNA 分子组装而成，16SrRNA 是其中一个组件。
       除了 16S，原核微生物的 rRNA 按沉降系数可以分为 5S、16S 和 23SrRNA，大小分别约为120bp、1540bp 和 2904bp（以 E.coli 为例），其中 5S rRNA 的基因序列较短，易于测定，但是由于其缺乏足够的遗传信息，不适用于系统分类研究。相反，23SrRNA 含有的核昔酸序列较长，分析较困难。       16SrRNA 占细菌总 RNA 量的 80%以上，基因序列长短适中，其结构中既有保守区域，又有变异区域，是较好的生物标志物。

      
       16S 结构示意图
       人们根据 16SrRNA 基因不同区域序列的可变性将其分为 9 个可变区和 10 个保守区(16S rDNA 扩增子测序(16S ribosome DNA ampliconsequencing)，通常是选择某个或某几个变异区域，利用保守区设计通用引物进行 PCR 扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，从而实现环境样品中微生物组成结构和种群分布特征的探索与发掘。

      
       二级和三级立体结构
       16S rRNA 包括 10 个保守区域和 9 个高变区域，对高变区核酸序列进行 NGS 测序, 可区分属特性，用于细菌的分类鉴定和系统进化。16S 扩增子测序通常是选择某个或某几个变异区域，利用保守区设计通用引物进行文库扩增，然后对高变区进行测序分析和菌种鉴定，16S rDNA 扩增子测序技术已成为研究样品中微生物群落组成结构的重要手段。
       最早使用 16S 进行物种分类是 Carl Woese，通过 16S 发现了古细菌，提出了“三域”学说。

      
       三界生物的 16S rRNA 的比较

3.2 18S
       18S rDNA 为编码真核生物核糖体小亚基 rRNA 的 DNA 序列。对 18S rDNA 某个高变区进行测序，用于研究环境样本中真核微生物群落结构多样性。

      
       18S 结构示意图

       18S 比 ITS 更保守。真菌是一类特殊的真核生物，它们拥有很高的物种以及种内多样性，而又有较高的序列保守性。

      
       18S 扩增引物分布
       18S 可以构建远距离的系统发育关系，但是对于鉴定物种或区分种内株系比较困难；ITS 是间隔序列相当于内含子，进化速率更快一点，因此可用来鉴定特定的物种和株系，但是对于远距离的系统发育关系构建是很难支持的。现在比较普遍的做法是 18S 和 ITS 结合，能够比较好的分析进化又能获得高的物种分辨率。


3.3 ITS
       ITS(Internal Transcribed Spacer)，内源转录间隔区，分为两个区域：ITS1 和 ITS2，ITS1 位于真核生物 rDNA 序列 18S 和 5.8S 之间，ITS2 位于真核生物 rDNA 序列 5.8S 和 28S 之间。ITS对区分所有真菌有 72%的成功率，因此 ITS 扩增是目前研究真菌的常用方法之一，用于研究环境微生物中真菌群落结构多样性。

      
        ITS 结构示意图

四、不同引物的选择
       由于 illumina 测序最长只能测序到 2*300bp，无法达到 16S 全长测序，因此只能测序 16S 的一部分区域。这就需要有所选择。目前 16S 有 9 个高变区，常用的扩增区域包括 V1-V2 区，V3-V4 区，V4-V5 区，V6-V8 区等。

      
       16S 高变区长度分布

       不同引物扩增产物不同，且针对不同物种有一定偏好性，选择不同的引物最终结果会有差别。有文章专门比较过不同扩增引物结果的差别。

       文章：PMID: 20880993
       从该文中结果中得出 V4 区域具有好的结果，一个可能的原因是 V4 区域较长。因此建议选择V3-V4，或者 V4-V5 区域。


五、不同测序平台 16S 测序比较
       由于测序技术的限制，目前的二代测序只能测序 16S 的部分区域，例如常用的 V3-V4 区域，且双末端具有一定的重叠区，可以进行连接。即使最长的 miseq 测序，2*300bp，拼接完也只有 500bp 左右，只有 16S 全长的 1/3。而使用 pacbio 和 nanopore 测序可以测序 16S 的全长，不过 pacbio 测序价格较高，nanopore测序错误较高，目前使用全长 16S 的并不多。不过随着技术的进步，已经有不少文章尝试使用三代全长 16S 进行分析。国内多家测序公司已经推出 nanopore 全长扩增子的测序产品。