临床样本检测

生信喵

一、文章简介
       《Nature Biotechnology》封面文章
       文章报道：摘自测序中国公众号文章报道
       《NBT 封面报道：6 小时精准识别下呼吸道病原体，纳米孔测序神助攻！附大会推荐》下呼吸道感染是全球传染病死亡的主要原因，仅 2016 年就导致 300 万人死亡。由于引发感染的病原体类型广泛，使得快速诊断和制定处方决策成为一项挑战。目前识别细菌感染的主要方法是细菌培养，通常需要 2~3 天时间，且敏感性较差。患者在此期间通常接受广谱抗生素治疗，从而可能加剧抗生素抗药性的问题。
国际顶级学术期刊 Nature Biotechnology 以《纳米孔上的临床宏基因组学》（Clinical metagenomics on a nanopore）为封面，刊登了英国东安格利亚大学 Justin O'Grady 博士及合作者共同发布的首个使用纳米孔技术的快速、经济的宏基因组测序方法，直接从患者呼吸道样本中准确快速地识别细菌病原体，并在 6 小时内准确检测抗性基因的突破性研究。
       据悉，为了能够准确、快速地识别细菌病原体，研究团队开发了一种能够从临床样本中去除多达 99.99％的宿主核酸的流程，并在便携式 MinION 测序仪上开展了实时的检测和分析。
       该团队在 40 个临床呼吸道样品上进行初期测试，在另外 41 个样品上进行了优化和测试。与培养法和 PCR 相比，优化的流程具有较高对病原体鉴定的敏感性（96.6％）和临床特异性（41.7％）。在使用定量 PCR 和病生菌特异性基因分析进行确认后，特异性和灵敏度增加至100％。使用该方法从样品到获得结果的周期为 6 小时，比培养法快了约 40 小时。
文章地址：

1. https://www.nature.com/articles/s41587-019-0156-5

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1.2 文章详细解读
       宏基因组公众号文章《NBT 封面：纳米孔基因组测序快速临床诊断细菌性下呼吸道感染》
文章亮点：
       1. 细菌性下呼吸道感染(LRI)培养法诊断敏感性差且太慢，不能指导早期的靶向抗生素治疗；
       2. 作者开发了一种用于细菌 LRI 诊断的宏基因组学方法，基于皂苷有效去除 99.99%的宿主DNA 并结合纳米孔测序；
       3. 该方法从样品到结果仅需 6 小时，对病原体检测的敏感性 96.6％、特异性 41.7％，同时可检测抗生素抗性基因；
       4. 结合定量 PCR 和特异性基因，特异性和灵敏度增加至 100％。
       5. 纳米孔宏基因组学可以快速准确地表征细菌 LRI，有助于减少广谱抗生素的使用。

二、下载数据

1. https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB30781

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三、病原微生物鉴定
       过滤宿主序列

1. #数据路径
   
2. #/data/PRJEB30781/
   
3. mkdir clincal;cd clincal
   
4. #去除宿主
   
5. REF=/MetaDatabase/human/GCF_000001405.39_GRCh38.p13_genomic.fna
   
6. READ=/data/PRJEB30781/P10.fastq.gz
   
7. minimap2 -ax map-ont $REF $READ -Y -N 20 -t 12 >minimap2.sam
   
8. samtools fastq -f 4 minimap2.sam | gzip >P10.filter.fq.gz
   
9. #统计过滤前后数变化
   
10. seqkit stat /data/PRJEB30781/P10.fastq.gz P10.filter.fq.gz

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      将过滤完的数据，使用 centrifuge 软件进行比对，过滤结果，挑选出其中呼吸道致病菌。

1. time centrifuge -x /MetaDatabase/centrifuge_h+p+v_20200318/hpv -U P10.filter.fq.gz --report-file report.tsv -S result.tsv -p 12 2>centrifuge.log

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       在使用centrifuge-kreport更改格式，再去R语言中pivian包可视化。

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批量操作

1. cd /data/PRJEB30781
   
2. ls -1 *.gz | while read i;do echo "1 $PWD/${i} ${i%.*.gz}.result ${i%.*.gz}.report";done;
   
3. #保存结果到temp.list中
   
4. awk '{print $1"\t"$2"\t\t"$3"\t"$4}' temp.list >sample_sheet.list
   
5. cat -T sample_sheet.list
   
6. #批量运行
   
7. centrifuge -x /ifs1/MetaDatabase/centrifuge_h+p+v_20200318/hpv --sample-sheet sample_sheet.list --min-hitlen 100 -p 12
   
8. #转换格式
   
9. ls *.result | while read i;do centrifuge-kreport -x /MetaDatabase/centrifuge_h+p+v_20200318/hpv $i >${i&.result}.kraken.tsv;done;

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