RNAseq 原理

生信喵

背景
实验设计
      
       RNAseq 实验设计评估
       RNAseq 实验需要多少样本，每个样本需要多少测序数据？RNAseq 主要考虑低丰度的基因是否能够被检测到，定量的结果是否准确。如果想要检测到低丰度表达，那么就需要足够的测序量，定量结果准确需要较多的生物学重复。
判定差异分析结果可靠性的指标主要包括假阳性，真阳性以及假阳性率和真阳性率几个指标。
       假阳性与真阳性：如果某个基因在 RNAseq 分析结果显示为差异表达，但 qPCR结果表明表达差异不显著，则认为是假阳性，反之则为真阳性。
       假阳性率（FPR）：真实非差异表达中基因中，被错误判定为差异表达基因的比率，FPR 越低越好。
       真阳性率（TPR）：真是差异表达的基因中，被正确判定为差异表达基因的比率，TPR 越高越好。


       零假设检验

      

一、生物学重复的影响
       文章中介绍，在单样本测序量保持不变的情况下，随着生物学重复数（n）的提高，差异表达分析的假阳性率（FPR）逐渐趋于稳定，真阳性率（TPR）不断提高。

      

二、测序数据量的影响
       在 RNAseq 实验中，在一定的生物学重复数（n）的情况下，随着单样本测序量（Depth）的提高，假阳性率（FDR）和真阳性率（TPR）都只是有限的提高。
       如果 Depth 等于 25%不变，当 n 从 2 提高到 12，TPR 的提高则是非常的明显，因此，测序深度对结果改善效果并不如增加生物学重复。

      
       测序数据量的影响

三、生物学重复与测序量的最佳组合
       该如何选择合适的样本数和测序数据量呢？在总数据量不变的情况下（总数据量通常代表总预算），如何选择生物学重复与测序量的最佳组合。如果

      
       生物学重复
       如上图所示，保持样本数不变，单个样本的数据量不断降低，TPR 的降低十分缓慢，例如当 n=3 时，单个样本的数据量从 100%降低到 15%，TPR 的值一直处于平台期，从 9%降低到 5%。


四、饱和度评估
       饱和度评估：通过随机抽取不同数据的 reads，计算检测到的基因数目。随着测序 reads 数据的增多，检测到的基因数目逐渐增多，当测序 reads 达到一定数目之后，检测到的基因数目不在增多，此时测序达到饱和，继续增加测序reads 数目，并不会提高检测基因表达的数目。

      
       饱和度评估


五、为什么要测序6G数据？
      
       对于中等表达的基因（RPKM>15），reads数=40M（在PE 150测序下，大概是6G数据量），就无论是构建还是定量逐渐达到平台期。备注：40M reads 也是有参转录组测序的推荐数据量
       注：图中数据为75bp读长的reads