利用monocle3分析单细胞数据

生信喵

       文档：https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/clustering/
一、读入数据

1. #1 读入数据
   
2. expression_matrix <- readRDS("monocle3/celegans/cao_l2_expression.rds")
   
3. cell_metadata <- readRDS("monocle3/celegans/cao_l2_colData.rds")
   
4. gene_annotation <- readRDS("monocle3/celegans/cao_l2_rowData.rds")
   
5. 
   
6. # Make the CDS object
   
7. cds <- new_cell_data_set(expression_matrix,
   
8.                          cell_metadata = cell_metadata,
   
9.                          gene_metadata = gene_annotation)

复制代码

二、数据处理
       数据处理包括表达数据标准化和批次效应的去除，对数据进行标准化使用 preprocess_cds函数，相当于 seurat 中 NormalizeData+ScaleData+RunPCA。

1. cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 100)

复制代码

      num_dim 是降维的维数，默认为 100，这里是根据各组成部分解释的差异散点趋势图，也可以自己调整，建议安装默认维数进行降维。

1. plot_pc_variance_explained(cds)

复制代码

      
       monocle3 数据处理

三、降维以及可视化
3.1 UMAP 方法

1. cds <- reduce_dimension(cds)
   
2. plot_cells(cds)
   
3. plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type")
   
4. 
   
5. #绘制特定基因在细胞中表达
   
6. plot_cells(cds, genes=c("cpna-2", "egl-21", "ram-2", "inos-1"))

复制代码

1. #可以使用多线程，前面读取好cds数据重新preprocess
   
2. cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 100)
   
3. cds <- reduce_dimension(cds, cores = 12)
   
4. plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type")
   
5. #和单线程的结果看起来差别不大，但是提醒是有差别的。

复制代码

3.2 tSNE 方法

1. cds <- reduce_dimension(cds, reduction_method="tSNE")
   
2. plot_cells(cds, reduction_method="tSNE", color_cells_by="cao_cell_type", group_label_size=3.5,cell_size = 0.8)

复制代码

3.3 去除批次效应

1. plot_cells(cds, color_cells_by="plate", label_cell_groups=FALSE)
   
2. cds <- align_cds(cds, num_dim = 100, alignment_group = "plate")
   
3. cds <- reduce_dimension(cds)
   
4. plot_cells(cds, color_cells_by="plate", label_cell_groups=FALSE)

复制代码

3.4 细胞聚类

1. cds <- cluster_cells(cds, resolution=1e-5)
   
2. plot_cells(cds)

复制代码

1. #使用PAGA算法进行聚类
   
2. plot_cells(cds, color_cells_by="partition", group_cells_by="partition")
   
3. 
   
4. #根据细胞类型进行涂色
   
5. plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type")
   
6. 
   
7. #更改细胞标注策略，不对聚类的进行标注。
   
8. plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type", label_groups_by_cluster=FALSE)

复制代码

四、 寻找 marker 基因

1. #寻找每个cluster的marker基因
   
2. marker_test_res <- top_markers(cds, group_cells_by="partition",
   
3.                                reference_cells=1000, cores=8)
   
4. 
   
5. 
   
6. #根据pseudo_R2方法对标记基因进行排序，取出每个cluster排名最高的基因
   
7. library(dplyr)
   
8. top_specific_markers <- marker_test_res %>% filter(fraction_expressing >= 0.10) %>% group_by(cell_group) %>% top_n(1, pseudo_R2)
   
9. top_specific_marker_ids <- unique(top_specific_markers %>% pull(gene_id))
   
10. 
    
11. #绘制每个cluster中不同marker基因的表达量
    
12. plot_genes_by_group(cds, top_specific_marker_ids, group_cells_by="partition",
    
13.                     ordering_type="maximal_on_diag",max.size=3)
    
14. 
    
15. #选取更多marker基因进行绘图
    
16. top_specific_markers <- marker_test_res %>%  filter(fraction_expressing >= 0.10) %>% group_by(cell_group) %>%  top_n(3, pseudo_R2)
    
17. top_specific_marker_ids <- unique(top_specific_markers %>% pull(gene_id))
    
18. plot_genes_by_group(cds,top_specific_marker_ids,group_cells_by="partition", ordering_type="cluster_row_col", max.size=3)
    

复制代码

五、 对细胞进行注释

1. #根据marker基因对细胞进行鉴定。
   
2. colData(cds)$assigned_cell_type <- as.character(partitions(cds))
   
3. #为每个cluster重新命名。
   
4. colData(cds)$assigned_cell_type <- dplyr::recode(colData(cds)$assigned_cell_type,
   
5.                                                  "1"="Body wall muscle",
   
6.                                                  "2"="Germline",
   
7.                                                  "3"="Motor neurons",
   
8.                                                  "4"="Seam cells",
   
9.                                                  "5"="Sex myoblasts",
   
10.                                                  "6"="Socket cells",
    
11.                                                  "7"="Marginal_cell",
    
12.                                                  "8"="Coelomocyte",
    
13.                                                  "9"="Am/PH sheath cells",
    
14.                                                  "10"="Ciliated neurons",
    
15.                                                  "11"="Intestinal/rectal muscle",
    
16.                                                  "12"="Excretory gland",
    
17.                                                  "13"="Chemosensory neurons",
    
18.                                                  "14"="Interneurons",
    
19.                                                  "15"="Unclassified eurons",
    
20.                                                  "16"="Ciliated neurons",
    
21.                                                  "17"="Pharyngeal gland cells",
    
22.                                                  "18"="Unclassified neurons",
    
23.                                                  "19"="Chemosensory neurons",
    
24.                                                  "20"="Ciliated neurons",
    
25.                                                  "21"="Ciliated neurons",
    
26.                                                  "22"="Inner labial neuron",
    
27.                                                  "23"="Ciliated neurons",
    
28.                                                  "24"="Ciliated neurons",
    
29.                                                  "25"="Ciliated neurons",
    
30.                                                  "26"="Hypodermal cells",
    
31.                                                  "27"="Mesodermal cells",
    
32.                                                  "28"="Motor neurons",
    
33.                                                  "29"="Pharyngeal gland cells",
    
34.                                                  "30"="Ciliated neurons",
    
35.                                                  "31"="Excretory cells",
    
36.                                                  "32"="Amphid neuron",
    
37.                                                  "33"="Pharyngeal muscle")
    
38. #重新绘图
    
39. plot_cells(cds, group_cells_by="partition", color_cells_by="assigned_cell_type")

复制代码

      
       每个 cluster 重新命名之后进行绘图