寻找marker基因以及细胞鉴定

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一、绘制每个群标记基因
       利用 FindMarkers 命令，可以找到各个细胞类型中与其他类别的差异表达基因，作为该细胞类型的生物学标记基因。其中 ident.1 参数设置待分析的细胞类别，min.pct 表示该基因表达数目占该类细胞总数的比例

1. #寻找每群标记基因
   
2. # find all markers of cluster 2
   
3. cluster2.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 2, min.pct = 0.25)
   
4. head(cluster2.markers, n = 5)
   
5. 
   
6. #一次寻找每个群标记基因
   
7. # find markers for every cluster compared to all remaining cells, report only the positive
   
8. # ones
   
9. pbmc.markers <- FindAllMarkers(pbmc, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
   
10. #通过test.use更换不同检测方法
    
11. cluster0.markers <- FindMarkers(pbmc, ident.1 = 0, logfc.threshold = 0.25, test.use = "roc", only.pos = TRUE)
    
12. 
    
13. #输出每个cluster中前三个基因
    
14. top3 <- pbmc.markers %>%  group_by(cluster) %>% slice_max(n = 3, order_by = avg_log2FC)
    
15. 
    
16. #方法二
    
17. top3 <- pbmc.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n=3,wt=avg_log2FC)
    
18. top3

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      对每群标记基因进行绘图，features 指定基因。

二、小提琴图
       小提琴图可以反映亚群中各个细胞的标记基因表达量分布，常用于细胞类型的验证；但是对于低表达比例的标记基因不敏感，

1. #1 小提琴图
   
2. VlnPlot(pbmc, features = top3$gene[1:3])
   
3. #使用原始count数
   
4. VlnPlot(pbmc,features = c("NKG7","PF4"),slot = "counts",log = TRUE)

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       markgene 在不同 cluster 中分布

三、FeaturePlot
       选择每群代表基因绘图，这种展示方法把基因表达量映射到 UMAP 结果中，同样可以直观的看到基因表达的特异性。
       基因映射图可以直观的表达标记基因在不同细胞中的分布情况，但是一张图里只能展示一个基因，检测多个基因时比较复杂，缺乏呈现对因素结果的能力，该图更适合用于展示基因的分布而非亚群细胞鉴定。

1. #2 FeaturePlot，选择每群代表基因
   
2. FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP","CD8A"))

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       markgene 映射在 umap 图中


四、热图
       热图综合反映基因表达水平，通过明暗变化展示标记基因在不同细胞亚群中的分布及细胞亚群中表达标记基因的细胞数量，但是绘制热图之前对数据进行了均一化处理，是敏感变化不明显。这样对于低表达的基因缺乏辨识度。

      
       markgene 分布热图

1. #4 其他绘图函数
   
2. top1 <- c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP","CD8A")
   
3. RidgePlot(pbmc,features = top1)
   
4. colnames(pbmc)[c(1,2)]
   
5. RidgePlot(pbmc,features = top1[3]) #山峦图
   
6. 
   
7. CellScatter(pbmc,cell1 = "AAACATACAACCAC-1",cell2="AAACATTGAGCTAC-1",features = top3$gene)
   
8. DotPlot(pbmc,features = top3$gene)+ NoLegend()
   

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五、定义细胞类型
       前面绘图中每个 cluster 只展示出数字 ，通过对比我们鉴定的 marker gene 与已发表的细胞类型特意的基因表 marker，可以定义我们划分出来的细胞类群。最后，将定义好的细胞类群加上名称。

       每个 cluster 标记基因与细胞类型

Cluster ID	Markers	Cell Type
0	IL7R, CCR7	Naive CD4+ T
1	CD14, LYZ	CD14+ Mono
2	IL7R, S100A4	Memory CD4+
3	MS4A1	B
4	CD8A	CD8+ T
5	FCGR3A, MS4A7	FCGR3A+ Mono
6	GNLY, NKG7	NK
7	FCER1A, CST3	DC
8	PPBP	Platelet

       该案例中根据每个 cluster 中 markgene，可以很容易鉴定出细胞类型，如果是其他数据，则需要通过额外方式，进行细胞类型鉴定。

1. #下面这个案例只适用于pbmc3k，其余两个案例需要去鉴定细胞类型
   
2. new.cluster.ids <- c("Naive CD4 T", "CD14+ Mono", "Memory CD4 T", "B", "CD8 T", "FCGR3A+ Mono","NK", "DC")
   
3. # "Platelet")
   
4. names(new.cluster.ids)
   
5. names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
   
6. pbmc <- RenameIdents(pbmc,new.cluster.ids)
   
7. levels(pbmc)
   
8. #重新绘图
   
9. DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

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       将细胞类型标记图中


六、软件版本信息

1. #显示软件版本
   
2. sessionInfo()

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