了解基因组拼接

生信喵

背景
为什么要拼接基因组？
      序列拼接也叫做基因组组装，是生物数据分析中最核心的工作。想要从基因组学角度来对一个生物进行研究，那么获得物种的全基因组序列，也就获得了其全部的遗传信息。这个就是序列拼接要完成的工作。

      
      生物数据分析流程图
      如上图所示，我们可以看到，序列拼接处于一个核心的位置，前期从样品提取，建库、测序等等做了大量工作，就是为了序列拼接这个步骤得到一个好的拼接结果。而在得到了拼接结果之后。就可以进行结构基因组学、功能基因组学以及比较基因组学的分析了。
其次，这些分析都依赖于序列拼接的结果，拼接结果的质量直接影响到后面分析结果的质量。例如序列拼接质量低，影响到基因预测，RNAseq 差异表达，可变监测识别，变异检测准确性等，所以，序列拼接这个步骤是处于整个数据分析中核心地位的。
当前虽然有很多物种基因组被发表出来，但这些基因组依然不是“完美的”，就拿做的最多的人基因组来说，目前使用的 hg38 人基因组上，依然有 8%左右的区域没有被拼接好。因此，拼接基因组依然是整个生物信息分析中最重要也是最难的工作。


一、目前已测序物种查询
      目前已经有大量物种被测序发表出来，可以通过下面的网站进行查询。该网站来自维基百科，如果无法访问，请使用科学上网方法。

1. <div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_plant_genomes</div><div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_eukaryotic_genomes</div><div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_archaeal_genomes</div><div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_bacterial_genomes</div><div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_fungi_genomes</div><div>      https://en.wikipedia.org/wiki/List_of_sequenced_plastomes</div>

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二、基因组序列下载
      常见的参考序列主要存储在国际三大核酸数据库 NCBI，EMBL，DDBJ 等，还包括 UCSC 以及一些物种单独的网站上。由于参考序列一般比较大，这里推荐使用 ftp 工具进行下载，ftp 工具是专门的针对 ftp 文件传输协议的工具，下载速度更快，并且支持断点续传，可以使用xftp 或者 filezilla 等访问 ftp 进行下载，也可以直接通过命令行 ftp 工具进行下载，例如 lftp 命令等。

      NCBI: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/
      EMBL：ftp://ftp.ensembl.org/pub/
      UCSC: http://genome.ucsc.edu/
      JGI：https://jgi.doe.gov/
      ENSEMBL：http://asia.ensembl.org/info/about/species.html


三、为什么基因组拼接比较难？
      为什么基因组不好拼接？一个物种的基因的基因组包含了其全部遗传信息，但是每个物种的基因组差别很大，目前的测序技术无法从基因组的第一个碱基测序到最后一个碱基，nanopore 测序理论上可以做到这样，但是你也无法获取完整的 DNA 序列。所以，需要利用基因组拼接。
      序列拼接是一项复杂的工作，影响序列拼接的因素有很多。这些因素有的影响比较大，而有的则很小。
      首先内在因素，是基因组本身的特点。自然界的生物千差万别，有着非常高的多态性，与之对应的基因组也存在高度的多态性复杂性。例如多倍体，基因组杂合，高度重复，低复杂度，GC 偏差等都会影响基因组的拼接，其中重复序列是影响最大的因素。来自于基因组上重复序列的 reads，由于测序读长短，无法分辨出具体来自于哪段重复区，在计算机眼里都是一样的。计算机在拼接发生歧义的地方就选择断开。这也就是为什么基因组无法拼接成一条的主要原因。
      外在因素包括测序的数据量，首先必须测序饱和，将基因组上所有的区域都覆盖到，只要测序到了才能够拼接出来。测序的质量会直接影响拼接的效果，例如测序错误率，duplication比率等。选择不同的文库大小会产生一定的影响，例如 350bp 或者 500bp，大的文库会跨过更长的重复序列，但是这个影响不是特别大。选择不同的 kmer 大小用来拼接也会有不同的结果，此外选择不同的拼接软件，设定不同的阈值都会影响到最终的拼接结果。


四、Denovo 拼接还是基于参考序列拼接？
      序列拼接我们也常常说成 denovo 序列拼接。denovo 是从头开始的意思。也就是不要基于原有的序列来拼接。将一大堆测序的短 reads 输入给拼接软件，就能够得到了一个物种的全基因组序列了。这个操作并不难，但是软件需要经过大量数据处理过程，序列拼接是一项非常复杂的工作。这是一项非常复杂的工作，需要非常大的计算。基因组拼接就是要利用denovo 的拼接方法。
      经常看到一种基于参考序列拼接的方法。利用这种方法得到的序列称为“一致性序列”，顾名思义，就是与参考序列保持一致。但这种方法得到的序列，并不是真实存在的基因组序列，所以不能使用基于参考序列的拼接方法。主要有以下原因：
      1、参考序列的准确性，已发表出来的参考序列并不是 100%准确的，如果参考序列中累积的错误，使用该方法，会被逐渐累积方法；
      2、该方法受参考序列影响很大，选择不同的参考序列就会得到不同的一致性序列；
      3、参考序列与测序物种之间存在差别，如果二者存在较大的结构变异，则无法突出这些结构变异；


五、需要多少计算资源？
      拼接基因组是非常消耗计算资源的，因为需要较大的计算量。不过无法统计具体的消耗总量。基因组拼消耗的计算资源与数据量大小，基因组复杂大，测序数据错误率，CPU 线程，磁盘读写速度，使用的算法等多个因素有关。
      要想知道具体计算资源消耗，需要根据具体案例来进行记录总结。可以使用 time，top 等命令对基因组拼接计算资源消耗情况进行记录。以下只给出基本配置，根据不同数据量以及复杂程度要有所增加。
      CPU：16 线程以上；
      内存：128G 以上；
      磁盘：1tb 以上；
      GPU：一般基因组拼接不需要。


六、选择哪种测序方法？
      最早的方案是只用 sanger 测序，例如人类基因组计划。后来有了 454 高通量测序，只是用454 测序进行拼接，但价格比较贵。后来有了价格便宜的 illumina 测序技术，但因为读长较短，只能采用不同大片段文库，以及 sanger 补洞的方案。以上这些方案目前已经不具备优势，被逐步淘汰。
      目前市场上还没有“完美”的测序方案，可以将基因组从头测到尾，因此，必须进行基因组的拼接工作。目前可以选择的测序方案有一代 sanger 测序，二代 illumina 以及 MGI，三代 pacbio以及 nanopore 测序。这几种测序方法各有优缺点。一代测序价格贵，不能进行高通量测序。
      二代测序价格便宜准确性高，但读长短。三代 nanopore 测序读长长，但是准确性差。读长和准确性都有所保障的 pacbio hifi reads，通量小，价格高。所以目前主要的方案是采用二代加三代的方案。取长补短，发挥各自测序平台的优势。
      对于多条染色体的复杂基因组，还需要结合 Hi-C 或者 Bionano 等技术，进行拼接结果的染色体挂载定位。


七、需要测序多少数据？
      基因组拼接至少需要将基因组上所有的位置都测序出来，也就是要覆盖全基因组。如果能够从头测到尾，只需要测序一次。随着 reads 长度的缩短，就需要更多的数据。下面表格中给除了在测序 reads 一定情况下，随着测序深度的增加，基因组覆盖度逐渐增加的案例。当达到 10x 数据，覆盖全基因组。但考虑测序随机性，GC 含量，基因组重复等影响，拼接一个物种的基因组，至少要达到 30X 以上的数据。

      

八、了解基因组大小方法
      在对一个物种进行测序拼接之前，需要知道一个物种的基因组大小。基因组大小是生物一个明显的特征以及一个非常重要的指标。通过知道物种的基因组大小，能够初步预估计算的复杂度。以及根据基因组大小决定测序数据量。基因组大小也是拼接完评估的一个重要指标。
      一般来说越复杂的生物基因组大小越大，例如哺乳类大于鸟类，鸟类大于真菌，原核生物大于病毒。因为越复杂的生物需要越多的基因完成功能，不过也有很多特例，例如植物由于是多倍体，基因组大小可能非常大。目前已经测序出很多物种，当然可以通过基因组序列得到，也有一些网站收集已知物种基因组大小，方便查询。

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8.1 获取基因组大小的方法
      1、如果没有查询到对应物种基因组大小，可以查找近源参考序列；
      2、测序完成之后，可以利用生物信息的方法推测基因组大小，例如 kmer；
      3、利用实验的方法是使用流式细胞仪估计基因组大小；
      4、当测序物种越来越多，原核生物，真菌，植物，动物等基因组还是具有一定的规律性的。


8.2 基因组大小查询网站
      1、动物：http://www.genomesize.com/search.php
      2、植物：http://data.kew.org/cvalues/
      3、真菌：www.zbi.ee/fungal-genomesize/
      4、原核生物：http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/ ... -prots/genomes.html


九、选择哪个拼接软件？
      不同的拼接软件代表不同的算法，例如适合 illumina 数据，适合 pacbio 数据的 。一般同一款软件只适合一种数据类型，尽量不要混用。因为软件是针对特定类型数据开发的。另外，不同软件在拼接结果，消耗资源，计算速度等方面会有差别，拼接出来的基因组会有差别，这是正常的。并且不同软件有不同偏好性，比如一些软件追求节省资源以及计算速度，拼接结果相对弱一些，另外一些软件追求更高的拼接质量，相应更加消耗资源以及计算时间。更具各自情况进行选择。
      建议，同一数据，选择多个拼接软件进行测试，综合评估结果。


十、长读长测序对于基因组拼接的作用？
      基因组拼接的目的就是将短序列连成更长的片段，而长读长测序无需拼接，则可以得到更长的片段。例如 illumina 测序双端长度只有 2*300。而 pacbio 直接就可以达到 20K 以上，nanopore 测序目前最高记录可以达到 4M 以上。
      长读长测序不仅可以直接得到很长的片段，也可以结合二代测序数据，连接二代测序拼接好的片段，或者用于补洞。
            长读长测序对于基因组拼接的巨大作用

十一、不同物种之间的差别
不同物种基因组之间存在较大差别，下面列出一些不同物种之间基因组拼接难度的总结。
      1、病毒：基因组较小，突变率高，高度杂合，测序覆盖度高，测序数据中包含宿主基因组，拼接难度大；
      2、细菌基因组：基因组较小，单倍体，基因组大小一般都小于 10M，重复率低，可以进行纯培养，最容易拼接；
      3、真菌：基因组在 10-100M 之间，有单倍体，也有多倍体，一般有多条染色体，拼接难度大于细菌；
      4、植物：基因组大小变化较大，一般有多条染色体，多倍体，重复序列多，基因组拼接难度较大；
      5、动物：基因组大小变化大，一般有多条染色体，二倍体，重复序列多，基因组拼接难度较大；
      6、人基因组：基因组为 3G，二倍体，23-24 染色体类型，重复序列多，拼接难度较大；
      7、宏基因组：包含多个物种，既包含原核生物也包含真核生物，也可能包含宿主，各个物种之间覆盖度不一致。
      8、小基因组：线粒体，叶绿体、质粒等，需要与“宿主”分开,很难分；
      9、转录组数据：转录本数据非全基因组，只需拼接出完整转录本即可，不追求“长度”；
      10、宏转录组：宏基因组与转录组组合，既有真核也有原核，难度较大。