纳米孔测序原理

生信喵

一、纳米孔测序关键字
      读长超长、速度快、准确性低、通量高、价格高、电信号、无GC偏向性、小的插入缺失错误、更新快
当前市场主流测序平台

      
纳米孔原理
      
之前的illumina测序是利用荧光信号的测序原理，下面介绍下荧光信号的特点
      1、需要利用PCR扩增添加荧光基团碱基；
      2、PCR限制了测序读长；
      3、PCR带来了扩增偏向性；
      4、PCR无法直接扩增RNA测序；
      5、测序仪=光学系统+化学反应体系+自动控制系统+计算系统+电力系统等
      6、需要等待合成反应时间，无法快速测序；
      7、测序原始结果存储为荧光值信号，无法实时处理；
      8、前期需要复杂的建库流程，添加接头，测序引物，barcode，index等；
      9、设备对环境条件要求较高；
      10、同一碱基被扩增很多次，荧光信号强度大，测序准确性高；（优点）

纳米孔是目前唯一使用电信号进行测序的设备，下面介绍纳米孔测序的原理
二、选择合适的纳米孔
      所谓纳米孔测序，就是让一条 DNA 链穿过一个纳米孔，因为构成 DNA 的四种碱基 ATCG，分别带有不同的电荷，在通过纳米孔的恒定的电场时，会引起电流的变化，不同的碱基会有不同的变化，根据这个电流的变化，就能区分开四种碱基分子，这就完成了 DNA 的测序。
      当前纳米孔材料主要分为两种：生物纳米孔和固态纳米孔。
      固态纳米孔有很多优点，首先它可以不是耗材，可以反复使用，而且性能更加稳定。但是固态纳米孔技术要求比较高，要实现 1 纳米的小孔，还比较困难。
      生物纳米孔是一种生物大分子。哪种生物大分子适合做生物纳米孔呢？这也是一项难度极大的工作。目前报道中提到过四种纳米孔，分别是α-溶血素，耻垢分枝杆菌孔蛋白 A MspA），噬菌体 phi29，大肠杆菌 CsgG 蛋白。
      
纳米孔技术三大难题
      1、纳米孔材料
      2、碱基识别精度
      3、控制碱基流动速度
纳米孔测序是如何工作的？
      

碱基流过纳米孔引起电流变化
      

三、纳米孔测序原理
      纳米孔测序技术开始于 90 年代，经历了三个主要的技术革新：一、单分子 DNA 从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。

四、建库测序
      原始的 DNA 或者 RNA 样品需要建库之后才能上机测序，所谓建库，就是将 DNA 或者 RNA格式化成固定的格式，传统的二代测序，以 illumina 测序为例，一般需要经过随机打断，加A 碱基，加测序引物，加 index 或者 barcode，加 adapter，扩增等过程。而 nanopore 测序的建库不需要繁琐的过程，从拿到 DNA 样品，最快 10 分钟就可以进行上机测序。nanopore建库主要是需要给待测 DNA 两侧加上测序接头以及马达蛋白。根据不同的研究目的，也可以进行混样建库，这就需要使用到 PCR，目前最多支持 96 个样品的混样建库。
建库完成的 DNA 分子
      
根据不同的样品以及不同的研究目的，可以选择不同的建库方法。在建库之前需要确定几个问题：
      1、DNA 还是 RNA？
      2、是需要快速还是长度？
      3、是否要 PCR？
      4、是否加 barcode？
      5、1D 测序，2D 测序还是 1D2 测序？
      
      确定好以上问题之后，既可以选择合适的建库试剂盒。为了适应不同的研究需求，目前纳米孔公司针对不同的情况，提供了很多种建库试剂可供选择。
      

不同测序试剂盒型号
      


DNA试剂盒
      
      一种叫做连接试剂盒。直接连。试剂与DNA直接反应。全长，但是慢，60min。适合于拼基因组，不赶时间。
      另一种，连的东西在转座酶上，然后转座酶开始进行切割，切割完将外接头、蛋白、转录酶接到DNA两端就连完了。快，10min，缺点是随机切，变短。适合于病原微生物快速鉴定、肿瘤检测。追求时间，比如新冠病毒宏基因组检测。

RNA试剂盒
      
      第一种，直接对RNA进行全长测序。能测到U碱基，不用反转录、扩增。反映RNA原始状态（发生甲基化、可变剪切等）。缺点：时间长，起始量需求大，需要polyA尾（真核生物）；
      第二种，对RNA进行反转录后再测，也是全长，损失甲基化等信息。需要PCR。
      第三种，不用PCR，对反转录后的测序，可以测更长。建库时间长。

是否使用PCR
      

是否添加barcode

      

基因组大小与平台及数据产出
      

如何计算产出数据量
      
单个纳米孔测序量：
      1秒：450bp个碱基：
      1分钟：450*60=27Kb
      1小时：27*60=1.62M
      1天：1.62*24=38.88M
      2天：38.88*2=77.76M
      3天：38.88*3=116.64M
不同数目纳米孔测序量（48小时）：
      126通道：126*77.76M=9.8G
      512通道：512*77.76≈39G
      3000通道：3000*77.76 ≈233G