stamp 分组比较

生信喵

一、利用 STAMP 分组检验
       如果一次测序多个样品，需要进行分组比较，可以选择 stamp 软件。STAMP 是一款用于分析微生物分类和功能谱的软件，不仅可以做统计，更能绘制多种图形，可直接放到文章中发表使用。stamp 完全图形化操作模式，支持两两分组，多样品分组比较。将很多复杂的组间统计检验模块化，只需点点鼠标即可完成，非常的方便。并且可以实时生成可视化的结果，包括条形图，箱线图，热图，PCA，散点图，带误差条的条形图等。
      
       stamp 部分可视化结果展示

二、软件安装
       软件支持 Windows、mac，Linux 等多个系统平台，选择自己的系统平台进行下载安装。
下载地址：

1. https://beikolab.cs.dal.ca/software/STAMP

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github 主页：

1. https://github.com/dparks1134/STAMP

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使用说明下载：

1. https://beikolab.cs.dal.ca/software/images/c/cd/STAMP_Users_Guide.zip

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图形案例：

1. https://beikolab.cs.dal.ca/software/STAMP_image_gallery

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三、输入文件
       stamp 不仅可以做物种组成差异的比较，还可以做功能差异的比较。stamp 默认支持一种列表格式结果，扩展名为 spf。同时也支持 biom 格式，MGRAST、IMG/M、CoMet、RITA 等软件的结果转换为 spf 格式。如果是使用 metaphlan，可以将 metaplan 的结果转换为 stamp支持的格式。如果是使用 kraken2，可以先生成 metaphlan 结果，再进行转换。利用metaphlan_to_stamp.pl 工具可以直接将 metaphlan 格式结果转换为 spf。也可以在 megan软件中输出 spf 格式结果。

1. #软件下载：https://github.com/LangilleLab/microbiome_helper
   
2. metaphlan_to_stamp.pl metaphlan2.tsv> metaphlan2.spf

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3.1 spf 文件
       spf 是一种表格数据，如下图所示，其中前面几列是物种分类的层级，可以有多列，这里是两列 phyla（门）和 genera（属）。接下来每一列对应样品中相对丰度。软件提供了一个checkHierarchy.py 脚本来检查文件格式。
      
       spf 格式文件

3.2 metadata 分组信息
       由于是要进行分组比较，因此需要一个分组信息列表，这个需要人为填写。分组信息至少需要两列，第一列样品名，第二列分组信息。分组有多个维度，例如采样点，国籍，临床症状，性别等等。多个分组方便后续进行多个维度的数据探索。关于分组信息如何填写，可以参考qiime 软件官网给出的建议：

1. http://qiime.org/documentation/file_formats.html

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      填写时注意一定要对应，有些情况下由于空白的关系，是列名没有正确对应，导致错误，最好在 excel 中验证一下。
      
       metadata 分组文件

3.3 导入数据
       如果是 spf 文件和 metadata，直接导入即可。如果是 biom，MG-RAST 等结果，需要先导入 STAMP 中进行转换，保存为 spf，再次导入。然后依次导入 spf 和 metadata。
      
       从其他软件结果导入 stamp

四、使用案例
4.1 多组比较——肠型
       安装好软件，Load data 打开 example 中的 EnterotypesArumugam 目录中的肠型数据(spf是数据矩阵，tsv 是实验设计)，打开默认显示 PCA 结果如下：
      
       展示 PC1-3 之间组合的散点图
       图片大小、关闭其它轴、图例位置等可以下方 Configure plot 中设置，图例在右侧，每组不同颜色，可在 Group field 中选择实验设计中不同的分组，分组可通过勾选进行取消或选择，并实时显示分析结果。(大数据时，请点击右下角实时计算，减少等待时间)

重现肠型分类
       选择右上角 Group field 为 Enterotype，去除后三个非主要分组，只保留三种肠型；同时左侧的数据属性中，Profile level 选择 Genera，现在我们可以看到三种肠型的不同形状在图中分开比较明显。
      
       PCA 图
              属性面板功能简介
       Parent level：标准化的总体范围
       Profile level: 分析的具体级别，如科、属、种或 OTU
       Unclassified: 末分类数据处理方法，分别为 Retain 保留、Remove 移除和仅用于计算比例。不同处理方法，结果会很大差异。
       Statistical properties：统计属性，主要包括统计检验方法，事后检验方法和置信区间，效应大小，多重检验校正方法等的选择；
       Filtering: 过滤阈值，主要是设置 P 值和效应大小。修改后，下方同步有符合条件的结果数量。方便在查看图表结果时只关注符合条件的 features。


4.2 图表类型介绍
       比较常用的是两组比较，本软件对多组比较支持也非常好，很容易进一步探索数据。

       柱状图：显示每个样品中 feature 的相对比例，并添加组均值，方便查看单个 Feature 的数据分布，如下图显示三种肠型中拟杆菌属的相对丰度。

      
       柱状图
       注：Feature 列表下方，可勾远 Show active 来只显示符合条件的结果。上图可以看出选了国家按p值排序点击第一个菌种，美国和意大利区别最大。

       热图：显示每个 Features 在样品中丰度的比例，优热在于不仅显示所有样本的丰度值，更可以对行 Features 和列样品进行聚类显示之间的关系；

       箱线图：简单快速显示组内数据分布。

      
       箱线图展示三种肠型中拟杆菌的相对丰度分布和整体统计 P 值
       主成分分析 PCA：散点图在低维空间显示高维数据间主要差异；
       Post-hoc 图：多组统计检验的无效假设(如 ANOVA 或 Kruskal-Wallis)是所有组相等。提供每对组间测量的 P-value 和效应大小。

      
       扩展柱状图/事后图显示组间两两比较柱状图，及置信区间分布和 P 值。
       图片的具体参数见 Configure plot 页面，可在 File 菜单中 Save plot 保存图片，有 PNG 位图，和 PDF, PS， EPS, SVG 共 4 种矢量图可选，推荐 PDF 格式方便查看和修改。