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发表于 2022-6-30 17:05:08
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背景
前面介绍的都是 reads 正常的比对情况，比上或者比对不上。在实际比对过程中还会出现很多种“特殊”情况，而往往分析需要的就是这种特殊情况。例如多重比对的 reads 分配问题，将 reads split 切割之后的比对，包括 spliced 与 clipped reads 的比对。
例如在RNAseq 分析中，由于真核生物存在可变剪切，会导致那些来自于不同外显子的 reads无法比对到基因上，所以，必须采用支持 spliced 比对策略的软件进行短序列比对才行。比较 bowtie 和 tophat 两种比对软件，很明显发现，支持 spliced 比对的方法能够比对上更多的 reads。前一篇推文我们介绍了hisat2的结果文件的确是大于bowtie2的结果文件。
一、spliced alignment
read 一端比对上，跳过了中间，然后另一端也比对上【CIGAR 中用“N”表示】如果是转录组数据的比对结果，N 表示内含子；其他类型组学数据中 N 也可以用，但没有意义，和 deletion一个意思。
二、clipped alignment
clipped alignment：切出两侧比对不上的，read 只有中间部分能比对上，两侧在比对过程中被忽略
三、soft-clipped 和 hard-clipped
clipped alignment 分为 soft-clipped 和 hard-clipped，在 SAM/BAM 的 CIGAR 列分别用“S”和“H”表示，比对完将 clipped 序列继续保留输出的，成为 soft-clipped，直接切掉不保留的称为 had-clipped。
那么什么时候标记 Hard clip，什么时候标记 Soft clip 呢？
- in bwa, HARD clipping is used for supplementary reads.
- if the read has a chimeric alignment, the paired
- or the top hit uses soft clipping ;All the other hits part of the chimeric alignment
- will use hard clipping
四、chimeric alignment
“嵌合比对” 的形成是由于一条测序 read 比对到基因组上时分别比对到两个不同的区域，而这两个区域基本没有 overlap。因此它在 sam 文件中需要占用多行记录显示。只有第一个记录被称作"representative",其他的都是"supplementary"【Chimeric reads are also called split reads】；RNA-seq 中的 chimeric read 或许可以说明有融合基因存在，但在基因组中一般作为结构变异的证据。
下面列出几个概念，这些概念类似，但又有一些差别，需要能够区分，主要是根据 reads 直接比对到多个区域，还是切开之后比对到多个区域。
represent alignment 与 supplementary alignment
supplementary alignment 是指一条 read 的一部分和参考区域 1 比对成功，另一部分和参考区域 2 比对成功，参考区域 1 和参考区域 2 没有交集（或很少），那么一条 read 就会产生两行比对记录输出。将其中的一条 sam 文件作为 represent alignment，而另一条作为 supplementary alignment。
primary 与 sencondary：
一条 reads 只输出一行比对结果的，属于(primary)，secondary 是指一条 read 可以比对到基因组上多个位置（>=2），可以是 read 使得同一部分有不同匹配区域，也可以是一条 read上的不同区域。输出的这些结果都称为secondary。
五、多重比对 reads 分配问题
对于多重比对的 reads，最终输出的结果可以设置多种模式，根据不同的需求来进行选择，一般软件中有很多选项参数可以控制输出。例如 bwa mem 软件中的“-Y -M”，minimap2 比对软件中的“-N -Y”等。对于多重比对，在计算的时候也会有影响，可以选择丢弃多重比对，
例如在做变异检测过程中。如果是在 RNAseq 分析中也可以选择平均分配，或者利用 Unique region 估计并重新分配等。这个地方就比较麻烦了。要记住有这些参数，该用时可以找到。
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