blast 的应用
本帖最后由 生信喵 于 2022-6-28 18:09 编辑一、物种鉴定
当拿到一条未知序列时，可以直接与 ncbi nt 库或者 nr 库进行 blast 比对，鉴定未知序列。
#nt库比对
blastn -db nt -query assembly.fasta -out blast.out-outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 12
二、基因功能注释
这种原理上与物种鉴定类似，也是通过比对，根据已知的信息来推测未知的信息。对于未知的基因，与基因功能数据库进行比对。过滤之后，比对到最近源基因所具有的功能，也就是未知基因具有的功能。这里我们看到，已知功能基因数据的准确性非常重要，否则未知基因功能就会被定义错误，如果这个错误累积起来，将会越累积越多。目前的基因功能注释主要都是采用这种方式。一般利用氨基酸的直接比对来做，比如可以做 nr 库、cog 数据库等。
#nr库比对
blastn -db nr -query gene.fa-out blast.out -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_threads 12
三、筛选质粒
#质粒数据库
ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/plasmid/ #质粒
#下载质粒数据库
alias 'aspera=~/.aspera/connect/bin/ascp -i
~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh -QTr -k 1 -l 50m'
#批量下载
for i in {1..10};do echo aspera
anonftp@ftp.ncbi.nlm.nih.gov:refseq/release/plasmid/plasmid.${i}.1.genomic.fna
.gz ./;done; #与质粒库进行 blast 比对
blastn -query assembly.fasta -db ../data/plasmid/plasmid.fa -out plasmid18.txt
-outfmt 6 -html -evalue 1e-5 -num_threads 12
#提取 id
cat plasmid.txt | awk '{if ($3 >80 && $4 > 100 ) print $1}' | sort | uniq >id.list
#提取序列
seqkit grep -r -f id.list assembly.fasta -w 0 >plasmid_4.fa
四、筛选共有基因。
将两个基因集氨基酸序列进行 blast 比对，将比对上的序列 ID 筛选出来。
#筛选共有基因
#建立索引
makeblastdb -in ref.faa -dbtype prot -parse_seqids -out ref.faa
#blastp比对
blastp -query query.faa -out blast.out -db ref.faa -outfmt 6 -evalue 1e-5
#筛选id
cat blast.out |awk '{if ($3 >=80 && $4 >=100 ) print $2}' | sort|uniq >id.list
#提取序列
seqkit grep -r -f id.list ref.faa
五、diamond 比对
5.1 diamond 介绍
diamond 是 2015 年发表的一款新的序列比对工具，与 blast 类似。diamond 可以应用于物种分类的鉴定，比对之后，直接导入 megan 软件进行物种分类以及数据可视化。相比于 blast程序，具有以下特点。
1、只能进行氨基酸水平比对，不能做核酸水平比对；
2、比对速度比 blast 程序快 100x-10,000x 倍；
3、可以进行长读长测序 reads 的比对；
4、可以输出 blast，sam 格式，列表已经 xms 等多种格式；
5、比对精度地域 blastp；
6、diamond 的软件版本要与数据库版本一致。
v0.9.25 to current produce format version 3 and accept format version 2-3.
v0.9.19 to v0.9.24 produce and accept format version 2.
v0.9.0 to v0.9.18 produce and accept format version 1.
v0.8.12 to v0.8.38 produce and accept format version 0. 网址：https://github.com/bbuchfink/diamond
5.2 软件安装使用
1 软件安装
#bioconda 安装
mamba install -y diamond
#现在预编译程序
wget
http://github.com/bbuchfink/diamond/releases/download/v2.0.13/diamond-linux64.
tar.gz
tar xzf diamond-linux64.tar.gz2 选项参数
https://github.com/bbuchfink/diamond/wiki/3.-Command-line-options
功能选项：
makedb ：建立索引
blastp：blastp 模式比对
blastx：blastx 模式比对
view：显示 DAA 格式结果
help：帮助信息
version：显示版本
getseq：从库文件中提取序列
dbinfo：数据库信息 、
test ：运行测试
makeidx：为数据库建立索引
通用选项：
--threads/-p： 线程数
--db/-d <file>： 输入比对数据库
--out/-o <file>： 输出文件
--outfmt/-f： 输出文件格式，默认 6（表格）
--header：输出表头信息
建库选项：
--in：输入文件
--taxonmap ：物种分类库 mapping 文件
--taxonnodes ：物种分类库 nodes 文件
--taxonnames：物种分类库 names 文件
比对选项：
--query/-q ：输入比对序列
--strand：比对方向
--evalue/-e： 比对的最大 evalue 值（默认 0.001)
--max-target-seqs/-k：比对到的最大序列数，默认值是 25
--top： 百分数的形式表示
--min-score：最小评分
--id: 给出指定百分比的数据
--subject-cover：最小覆盖度
选择比对速度与敏感度
--fast
--mid-sensitive
--sensitive
--more-sensitive
--very-sensitive
--ultra-sensitive
5.3 使用案例
1、blastp 比对
#建立索引
diamond makedb --in ref.faa --db ref
diamond 比对
diamond blastp -q query.faa -d ref -o blastp.txt -p 12 -f 62、物种鉴定
#检查数据库版本
diamond dbinfo -d /nr_diamond/nr.dmnd
diamond dbinfo -d /diamond_20210825/nr.dmnd
#diamond 比对
diamond blastx -q P15.fastq.gz --db diamond
/diamond_20210825/nr -o blastx -p 12 -f 100
#可视化
diamond view -a blastx.daa
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