qiime2实战
本案例是 qiime2 官方教程中的案例，来自于文章《Moving pictures of the human microbiome》在 2011 年发表于 Genome Biology。主要是为了研究人体微生物在使用抗生素之后动态的变化，选取 2 个人，四个身体部位，五个时间点的微生物组样本进行测序研究，第一个时间点紧接着是抗生素的使用，一共 40 个测序样品。本教程中使用的数据基于 Illumina HiSeq 产出，使用地球微生物组计划扩增 16S rRNA 基因高变区 4（V4）测序的方法。
https://docs.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/一、准备数据centos安装docker
#移除docker旧版本
sudo yum remove docker docker-client docker-client-latest docker-common docker-latest docker-latest-logrotate docker-logrotate docker-selinux docker-engine-selinux docker-engine
#安装必要的系统工具
sudo yum install -y yum-utils device-mapper-persistent-data lvm2
#添加软件源信息
sudo yum-config-manager --add-repo http://mirrors.aliyun.com/docker-ce/linux/centos/docker-ce.repo
#更新yum缓存
sudo yum makecache fast
#安装docker ce
sudo yum -y install docker-ce
systemctl start docker
docker run hello-world
systemctl status docker
systemctl stop docker
#docker阿里云加速
#/etc/docker/daemon.json中写入如下内容(如果文件不存在请新建该文件)
{
"registry-mirrors":["https://alzgoonw.mirror.aliyuncs.com"]
}
sudo systemctl daemon-reload
sudo systemctl restart docker
#测试
sudo groupadd docker #添加用户组
sudo gpasswd -a xiehs docker #将当前用户添加至用户组
newgrp docker #更新用户组
#docker run hello-world安装qiime2
#docker安装
docker pull quay.io/qiime2/core:2022.2
#验证docker安装
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime
二、下载及拆分数据
mkdir qiime2-moving-pictures-tutorial
cd qiime2-moving-pictures-tutorial
#下载metadata
wget \
-O "sample-metadata.tsv" \
"https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/sample_metadata.tsv"
#下载测序数据
mkdir emp-single-end-sequences
wget \
-O "emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz" \
"https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/barcodes.fastq.gz"
wget \
-O "emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz" \
"https://data.qiime2.org/2023.2/tutorials/moving-pictures/emp-single-end-sequences/sequences.fastq.gz"
#导入数据
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools import \
--type 'EMPSingleEndSequences' \
--input-path emp-single-end-sequences \
--output-path emp-single-end-sequences.qza
#查看信息
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools peek emp-single-end-sequences.qza
#解压文件
#unzip emp-single-end-sequences.qza
#=========================
#2 拆分样品Demultiplexing #
#=========================
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime demux emp-single \
--i-seqs emp-single-end-sequences.qza \
--m-barcodes-file sample-metadata.tsv \
--m-barcodes-column barcode-sequence \
--o-per-sample-sequences demux.qza \
--o-error-correction-details demux-details.qza
#总结信息
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime demux summarize \
--i-data demux.qza \
--o-visualization demux.qzv
#查看信息https://view.qiime2.org/ 将qzv下载到本地，打开qiime浏览器上传。
根据 barcode 拆分之后统计
交互式质控图
#查看当前步需要引用的文献
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime tools citations demux.qza
三、质控过滤以及生成特征表方法一：data2
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime dada2 denoise-single \
--i-demultiplexed-seqs demux.qza \
--p-trim-left 0 \
--p-trunc-len 120 \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-table table.qza \
--o-denoising-stats stats.qza
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime metadata tabulate \
--m-input-file stats.qza \
--o-visualization stats.qzv方法二：deblur
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime quality-filter q-score \
--i-demux demux.qza \
--o-filtered-sequences demux-filtered.qza \
--o-filter-stats demux-filter-stats.qza
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime deblur denoise-16S \
--i-demultiplexed-seqs demux-filtered.qza \
--p-trim-length 120 \
--p-sample-stats \
--o-representative-sequences rep-seqs-deblur.qza \
--o-table table-deblur.qza \
--o-stats deblur-stats.qza
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime metadata tabulate \
--m-input-file demux-filter-stats.qza \
--o-visualization demux-filter-stats.qzv
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime deblur visualize-stats \
--i-deblur-stats deblur-stats.qza \
--o-visualization deblur-stats.qzv 如果使用这个方法，就将生成的文件名修改为方法一
mv rep-seqs-deblur.qza rep-seqs.qza
mv table-deblur.qza table.qza
四、特征表和特征序列汇总
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime feature-table summarize \
--i-table table.qza \
--m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv \
--o-visualization table.qzv
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime feature-table tabulate-seqs \
--i-data rep-seqs.qza \
--o-visualization rep-seqs.qzv 将qzv下载到本地，打开qiime浏览器上传查看。
五、构建进化树用于多样性分析
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences rep-seqs.qza \
--output-dir phylogeny-align-to-tree-mafft-fasttree
#或者
docker run -t -i -v $(pwd):/data quay.io/qiime2/core:2022.2 qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
--i-sequences rep-seqs.qza \
--o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
--o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
--o-tree unrooted-tree.qza \
--o-rooted-tree rooted-tree.qza 可以将tree.qza文件解压后，data目录下nwk文件下载到本地，上传至https://itol.embl.de/网站即可看到发育树。
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