三代纳米孔宏基因组拼接
本帖最后由 生信喵 于 2022-12-28 21:10 编辑背景
（1）纳米孔宏基因组测序的优点：纳米孔测序技术有着独一无二的优势，具体有8点，
1.DNA/RNA直接测序
2.可扩展性:便携式或台式测序仪
3.真正的实时性
4.10分钟文库制备
5.无需对测序设备的资金投入
6.高保真度
7.超长读长
8.对大基因组的高数据量测序
（2）利用Nanopore测序拼接的优势
1、超长读长，解决重复序列问题；
2、超长读长解决相位问题；
3、超高通量测序，单张芯片最大可产出300G以上数据；
一、纳米孔测序宏基因组拼接下载数据
从宏基因组测序中拼接细菌完成图，《Complete and validated genomes from a metagenome》2012 年加拿大 Northern Alberta 油砂尾矿池附近海藻细菌培养分离样品，2019 年重新培养提取。
纳米孔测序宏基因组拼接案例
二、利用 metaFlye 拼接基因组
flye 软件原来叫做 abruijn，是一款适合单分子测序的拼接软件，可以用于 Pacbio 与 nanopore测序数据。flye 适合拼接多种数据集，从小的细菌基因组到很大的哺乳动物基因组。flye 其实也是一个完整的拼接流程，首先原始测序数据作为输入，最后就可以直接输出经过纠错校正的基因组序列，同时给出拼接结果统计。flye 也有一个独立的模块 metaFlye 可以用来拼接宏基因组。
软件官网：https://github.com/fenderglass/Flye
查看数据：
seqkit stat ERR3994080_1.fastq.gz
file formattypenum_seqs sum_lenmin_lenavg_lenmax_len
ERR3994080_1.fastq.gzFASTQ DNA 724,7346,557,524,714 29,048.2195,618 之前我们用二代数据megahit拼接完，最长才48k多，这个纳米孔原始数据最长就已经19k多了。
使用案例
就像它简介的名字一样，flye 使用起来也非常简单。直接输入 pacbio 或者 ont 的测序数据即可，可以是 fasta 格式，也可以是 fastq 格式文件，支持压缩格式。可以是原始数据，也可以是纠错后的数据，但需要通过选项参数分别设定。
conda install -y flye
echo "time flye --nano-raw ERR3994080_1.fastq.gz --genome-size 200M --out-dir flye --meta --threads 24 1>flye.log 2>flye.err" >flye.sh
bsub -q fat -n 24 -o %J.log -e %J.err sh flye.sh常用选项参数：
--pacbio-raw ：输入原始 pacbio 数据
--pacbio-corr ：输入纠错后的 pacbio 数据
--nano-raw：输入原始 nanopore 数据
--nano-corr ：输入原始 nanopore 数据
--genome-size：预估基因组大小，用于评估覆盖深度
--out-dir：输出结果文件路径
--threads：cpu 线程数据
--iterations：纠错迭代次数
--min-overlap：最小 overlap 连接大小
--meta: 拼接宏基因组数据
--plasmids: 拼接质粒数据
输出结果
total 404M
drwxrwxr-x 2 xiehs xiehs 4.0K Dec 28 17:07 00-assembly/
drwxrwxr-x 2 xiehs xiehs 4.0K Dec 28 17:23 10-consensus/
drwxrwxr-x 2 xiehs xiehs 4.0K Dec 28 17:34 20-repeat/
drwxrwxr-x 2 xiehs xiehs 4.0K Dec 28 17:36 30-contigger/
drwxrwxr-x 2 xiehs xiehs 4.0K Dec 28 18:13 40-polishing/
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs 92 Dec 28 18:13 params.json
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs 328K Dec 28 18:13 assembly_graph.gv
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs 202M Dec 28 18:13 assembly_graph.gfa
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs 198M Dec 28 18:13 assembly.fasta
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs52K Dec 28 18:13 assembly_info.txt
-rw-rw-r-- 1 xiehs xiehs 2.8M Dec 28 18:13 flye.log
最后结果目录中有三个文件比较重要。
1、assembly.fasta ：最终拼接得到的基因组序列，fasta 格式。
2、assembly_graph.{gfa|gv} ：拼接过程中用到的 repeat graph。
3、assembly_info.txt：拼接结果统计信息，也可以自己单独使用 seqkit 工具统计。
总结
1、软件使用简单；
2、自带纠错功能；
3、可以拼接宏基因组和质粒；
grep '\bY\b' assembly_info.txt
contig_1389 5785557 17 Y N 1 * 1389
contig_765 5143764 118 Y N 4 * 765
contig_308 4678198 21 Y N 1 * 308
contig_227 4471145 116 Y N 4 * 227
contig_777 4139087 13 Y N 1 * 777
contig_37 3976090 20 Y N 1 * 37
contig_1311 3954350 69 Y N 2 * 1311
contig_307 3834242 83 Y N 3 * 307
contig_1258 3764263 15 Y N 1 * 1258
contig_1287 3740429 47 Y N 2 * 1287
contig_1074 3729233 38 Y N 1 * 1074
contig_282 3220921 18 Y N 1 * 282
contig_268 3174875 237 Y N 9 * 268
contig_517 3147655 429 Y N 16 * 517
contig_1403 2881730 43 Y N 1 * 1403
以上15个可能是拼好的环状基因组
samtools faidx assembly.fasta contig_1389 >contig_1389.fasta
samtools faidx assembly.fasta contig_765 >contig_765.fasta
samtools faidx assembly.fasta contig_308 >contig_308.fasta
可以与nt库比较出是哪个物种，网页ncbi比较也可以。
head contig_1389.fasta
序列复制去 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 鉴定。
当然也可以用centrifuge软件物种鉴定。
awk -F "\t" '{if ($4 == "Y" && $2 >= 300000) print $0}' assembly_info.txt | wc
拼接结果筛选，原文大于300k，排除线粒体。
目前16个，原文13个。
awk -F "\t" '{if ($4 == "Y" && $2 >= 300000) print $1}' assembly_info.txt | xargs
contig_1389 contig_765 contig_308 contig_227 contig_777 contig_37 contig_1311 contig_307 contig_1258 contig_1287 contig_1074 contig_282 contig_268 contig_517 contig_1403 contig_795
samtools faidx assembly.fasta contig_1389 contig_765 contig_308 contig_227 contig_777 contig_37 contig_1311 contig_307 contig_1258 contig_1287 contig_1074 contig_282 contig_268 contig_517 contig_1403 contig_795 >16.fasta
再用centrifuge软件物种鉴定。也可以复制去ncbi比对。
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